●文献解析|Cell—scRNA-seq助力揭示中性粒细胞抗肿瘤免疫新途径
来自意大利Humanitas大学的Mantovani教授和Jaillon博士报道了免疫系统中抵抗肿瘤，特别是某些类型肉瘤和结直肠癌的新“士兵”——CD4-CD8-非常规αβ T细胞。通过巨噬细胞产生的IL-12驱动，中性粒细胞调控CD4-CD8-非常规αβ T细胞极化生产IFN-γ，介导抗肿瘤免疫【1,2】。
值得思考的是，这篇文献展示了另一种使用单细胞RNA测序技术的思路：使用scRNA-seq技术在单个细胞水平上深入认识传统分析手段得到的结果。在该文献中，Mantovani教授和Jaillon博士在使用传统的流式细胞、qPCR、PrimeFlow RNA分析等方法认识中性粒细胞在癌症发生和肿瘤发展中的作用后，采用scRNA-seq技术解析关键细胞类型的异质性。
此外，Mantovani教授和Jaillon博士还使用TCGA（the Cancer Genome Atlas database）中肉瘤的公共RNA测序数据以及Xena Browser中黑色素瘤数据进行受试者工作曲线分析，探讨其研究结果是否能在选定的人类肿瘤中得到验证。
影响因子：36.216
通讯作者：Humanitas大学的Mantovani教授和Experimental Immunopathology实验室Jaillon博士。
开放数据：文章中使用的bulk和单细胞RNA测序数据储存在NCBI GEO数据库，编号分别是GSE109031和GSE123508。
肿瘤微环境中存在着的中性粒细胞受肿瘤细胞和免疫细胞产生的信号的调控【3-5】。中性粒细胞和骨髓生长因子-粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与肿瘤进展有显著关系【3,6】。但也有报道指出中性粒细胞释放的效应因子介导了抗肿瘤抗性【7-8】。除了常规T细胞外，中性粒细胞还可以调控γδ T细胞的激活，在癌症中调控其生产介素(IL)-17A【9】。
对中性粒细胞在癌变和肿瘤进展中作用的研究基本上是基于抗体介导细胞衰竭的方法【5,10】。这种方法的内在局限包括持续时间，特异性和系统干扰【10-12】。因而在该研究中，研究者利用G-CSF-R遗传缺陷和3-甲基胆碱(3-MCA)诱发癌变这一经典模型【13-15】，评估中性粒细胞在癌变和肿瘤进展中的作用。
敲除G-CSF-R(Csf3r-/-)会使得小鼠外周血的中性粒细胞显著减少【16】。通过比较Csf3r-/-小鼠和Csf3+/+小鼠3-MCA诱导肿瘤的发生发展情况，以及过继转移实验，研究者发现中性粒细胞能预防原发3-MCA肉瘤形成。
进一步研究后，研究者发现中性粒细胞的保护作用依赖1型免疫和IFN-γ的产生；中性粒细胞特异性调控癌变阶段DNTαβ细胞（CD4-CD8-双阴性αβ T细胞）的极化；与其他T细胞群相比，UTCαβ细胞（非常规αβ T细胞）对IL-12更敏感（图1）。
图1 A是Csf3r+/+和Csf3r-/-肿瘤相关UTCαβ中转录组差异表达热图；B-D是未治疗Csf3r+/+小鼠脾脏分离出的T细胞中，Il12rb1和Il12rb2、Il1r5和Il1r7的mRNA表达水平，以及IFN-γ的表达水平；E是IL-12p70中和抗体或同型对照处理后，3-MCA注射点浸润UTCαβ的T-bet、Eomes和IFNg表达；F是预测的肿瘤浸润性Csf3r+/+和Csf3r-/- UTCαβ上游调控因子活性；G是IL-12p70水平；H是初始脾脏αβ T细胞子集中IFN-γ的表达水平；I是IL-2、IL-12和IL-18共刺激24h后Csf3r+/+肉瘤浸润T细胞中IFN-γ表达量。
虽然通过流式细胞分析结果认识到UTCαβ细胞存在不同亚群，但为了深入认识肿瘤相关UTCαβ的多样性，研究者使用scRNA-seq分析Csf3r+/+（14,721个细胞）和Csf3r-/-（16,902个细胞）小鼠模型3-MCA诱导肉瘤癌变中的肉瘤浸润性UTCαβ细胞。
（1）对得到的所有单个细胞转录组数据进行降维聚类，发现存在12个细胞聚群，其中聚群1-4占全部UTCαβ细胞的75%以上，且在Csf3r+/+和Csf3r-/-中存在富集差异（图1）。
图2 Csf3r+/+和Csf3r-/-中得到的肉瘤浸润性UTCαβ细胞降维聚类结果【2】。
2）根据差异表达基因热图，可以发现（图3）：
◉聚群1和3在Csf3r-/-肉瘤中富集，与MAIT细胞（粘膜相关恒定T细胞）表型相一致基因（Cxcr6、Rorc等）、Rorγt+ DNTαβ细胞3型极化状态相一致基因（Il17a等）显著表达【17,18】；
◉聚群2和4在Csf3r+/+肉瘤中富集，高表达与T-bet+ DNTαβ细胞1型激活态相一致的效应分子（Gzmb等）以及Ly49家族相关基因（Klra1等）；
◉聚群5展现出与iNKT细胞（恒定自然杀伤T细胞）相关的基因标记；
图3 不同细胞聚群的差异表达基因热图【2】。
（3）根据相关性分析和通路富集分析，发现（图4）：
◉存在两个主要的功能差异群体，这反应了Csf3r+/+和Csf3r-/-肉瘤UTCαβ细胞组成差异；
◉Csf3r+/+肉瘤细胞聚群（聚群2和4）中富集了STAT4介导的IFN-γ信号和IL-12信号。结合主要在聚群2和4中发现Il12rb2表达这一结果（图3），证实了聚群2和4对IL-12的灵敏度更高。
◉Csf3r+/+肉瘤细胞聚群（聚群2和4）中富集了与先天样T细胞活性和细胞毒性活动相关的基因标记。
图4 相关分析和通路富集分析结果。左图是相关分析结果，显示12个细胞聚群中主要存在两个功能差异聚群集：红色是类型1，在Csf3r+/+肉瘤中富集；绿色是类型3，在Csf3r-/-肉瘤中富集【2】。
（4）为了更好的描述这12个UTCαβ细胞聚群及其功能特征，研究者对关键生物学通路相关基因的表达差异进行分析，特别评估了细胞增殖【19】、细胞迁移【20】、共刺激分子和免疫检查点【21】，以及效应分子【22】相关基因在不同聚群中的表达差异（图5）：
◉聚群11是唯一处于活性增殖的子集；
◉聚群1和3特异性表达免疫检查点（Icos等）和趋化因子受体（Cxcr6等）相关基因；
◉聚群2和4表达几种效应分子（如Gzmb、Gzmd和Prf1），一组不同的趋化因子受体和共刺激分子，包括Cxcr3等；
◉与其他UTCαβ细胞聚群不同的是，聚群12表达功能活跃、终末分化的T细胞相关基因，如Gzmk、Gzma等；
◉聚群9表达典型的初始T细胞迁移分子相关基因，如S1pr1、Ccr7和Sell。
图5 与某些生物学功能相关基因的差异基因表达热图。C-E分别展示了与迁移能力、增殖、检查点和共刺激分子，以及杀伤性中间物相关的差异基因表达热图【2】。
（5）使用T细胞极化相关分子（如Tbx21和Rorc）、效应分子功能（如Gzmb、Ifng和Il17a）和活性状态（如Nr4a1、3）基因集进行伪时间轨迹分析，结果显示（图6）：
◉12个UTCαβ细胞聚群存在5种不同的功能状态；
◉3型极化细胞（聚群1和3）和1型极化细胞（聚群2和4）位于轨迹末端的相反位置，代表了一系列功能状态的极值；
图6 伪时间轨迹分析结果以及每个聚群中5种状态所占据的比例【2】。
一直以来，研究者们认为T细胞和INF-γ介导了对3-MCA诱发癌变的抗性【14,15】。但是经过5年研究，Mantovani教授和Jaillon博士首次揭示了3-MCA诱发肉瘤的TME（肿瘤微环境）中，UTCαβ细胞的存在、多样性及其抗肿瘤能力，并表明中性粒细胞可以保持Ly49+ DNTαβ细胞的抗肿瘤能力。
该研究结果表明存在中性粒细胞/INF-γ抗性通路，靶向DNTαβ细胞抑制性受体可以作为当前检查点抑制疗法PD-1和CTLA-1的替代或补充疗法，为抗癌提供了新思路。
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